در حوزه پزشکی دستگاه‌های بسیاری ساخته و طراحی شده‌اند. یکی از مهم‌ترین دستگاه‌ها در این حوزه، دستگاه ریل تایم پی سی آر است. این دستگاه در زمینه DNA بسیار کاربردی است. البته ما در ادامه به شما توضیحات کاملی درباره ریل تایم پی سی آر چیست؟ می‌دهیم و همچنین به صورت کامل درباره مزیت‌های استفاده از این دستگاه به شما خواهیم گفت.

اصل Real Time PCR

تکنیک‌های تقویت و تشخیص نوکلئیک اسید یکی از ارزشمندترین ابزارها در تحقیقات بیولوژیکی امروزی است. دانشمندان در تمام زمینه‌های علوم زیستی، تحقیقات پایه، بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی قانونی، تشخیص و موارد دیگر از این روش‎ها در طیف گسترده‌ای استفاده می‌کنند. برای برخی کاربردها، تشخیص کیفی اسید نوکلئیک کافی است. با این حال، برنامه‌های دیگری هستند که نیاز به تجزیه و تحلیل کمی دارند. Real-time PCR را می‌توان برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی استفاده کرد.

Real-Time Quantitative PCR (همچنین به عنوان qPCR شناخته می‌شود) روشی برای یافتن مقدار بخش خاصی از DNA در یک نمونه، در زمان واقعی است. این دستگاه، این اجازه را به شما می‌دهد تا بخش‌هایی از DNA را (یا اسیدهای نوکلئیک) به طور همزمان غربال کنید. این دستگاه همچنین به شما در زمینه ژنتیک سلولی یا سیتوژنتیک (علم مطالعه ساختمان کروموزوم‌ها) نیز کمک می‌کند.

بیشتر بدانید : کشت سلول چیست و چگونه انجام می شود؟

روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)

ظهور Real-time PCR و زمان واقعی PCR رونویسی معکوس (Real-time RT-PCR) زمینه اندازه گیری بیان ژن را به طرز چشمگیری تغییر داده است. Real-time PCR تکنیک جمع‌آوری داده‌ها در طول فرآیند PCR است، بنابراین برای تقویت و تشخیص استفاده می‌شود.

دو روش مختلف برای ارائه بیان ژن کمی وجود دارد: کمیت مطلق و نسبی. کمیت مطلق تعداد ژن را معمولاً با ربط دادن سیگنال PCR به منحنی استاندارد محاسبه می‌کند. اما در بیان ژن نسبی، داده‌های ژن مورد نظر را نسبت به برخی کالیبراتور یا ژن کنترل داخلی نشان می‌دهد. یک روش پرکاربرد برای ارائه بیان نسبی ژن، روش مقایسه‌ای CT است.

مزایای روش ریل تایم (Real time PCR)

استفاده از هر دستگاه آزمایشگاهی در کنار معایب، یک سری مزایا نیز دارد. که معمولا مزایای استفاده از آن دستگاه بیشتر از معایب آن است وگرنه اصلا مورد استفاده قرار نمی‌گرفت. ریل تایم پی سی آر یکی از آن موارد است که مزایای استفاده از آن حتی در دوران کرونا هم زبانزد بوده است. برای آشنایی بیشتر با مزایای روش ریل تایم پی سی آر به موارد زیر توجه داشته باشید.

• از مزایای قابل توجه PCR بلادرنگ شامل توانایی آن در اندازه گیری غلظت DNA در محدوده وسیع می‌توان اشاره کرد.
• همچنین می‌توان به توانایی پردازش چندین نمونه به طور همزمان و توانایی آن در ارائه اطلاعات فوری اشاره کرد.
• روشی مقرون به صرفه است.
• از نظر زمانی کارآمد است.
• روش کمی PCR حساس‌تر، خاص و کارآمدتر است.

مراحل Real Time PCR (پروتکل)

مراحل استفاده و کار با ریل تایم پی سی آر کمی پیچیده است اما ما در این بخش به زبان ساده برای شما تمامی این مراحل را توضیح داده‌ایم تا در زمان استفاده از این دستگاه با یادآوری این مقاله در کمترین زمان ممکن بهترین عملکرد را داشته باشید. به طور کلی مراحل استفاده از ریل تایم به 2 قسمت تقویت و تشخیص تقسیم می‌شود، که مورد اول یعنی تقویت خود شامل چند مرحله است که در ادامه با آن‌ها آشنا می‌شوید.

تقویت یا SYBR

این کار با بخشی از نمونه DNA در یک لوله مناسب همراه با معرف‌ها و مواد شیمیایی آزمایشگاهی (یک نمونه DNA یا RNA، پرایمرهای DNA، DNA پلیمراز و …) آغاز می‌شود. لوله یا همان کیت آزمایشگاهی در دستگاه PCR یا سیکلر حرارتی قرار می‎گیرد. چرخاننده حرارتی محلول را از طریق یک فرآیند 3 مرحله‌ای دریافت می‌کند: دناتوراسیون، بازپخت و گسترش.

مرحله 1؛ دناتوره سازی

محلول موجود در لوله با استفاده از یک سیکل حرارتی تا حداقل 94 درجه سانتیگراد (201.2 درجه فارنهایت) گرم می‌شود. گرما پیوندهای هیدروژنی نمونه اصلی DNA را می‌شکند و DNA را به رشته‌های منفرد جدا می‌کند (به این دناتوره شدن DNA دو رشته‌ای گفته می‌شود).

مرحله 2؛ بازپخت

مخلوط نمونه سپس بین 50 تا 60 درجه سانتیگراد (122 تا 140 درجه فارنهایت) خنک می‌شود و به پرایمرهای DNA و آنزیم DNA پلیمراز اجازه می‌دهد تا به رشته‌های جداگانه DNA که توسط گرما از هم جدا شده‌اند متصل شوند. در این مرحله، نوکلئوتیدها (A، T، C، G) از محلول مخلوط اضافه شده با رشته‌های جدا شده از DNA که از فرآیند گرمایش حاصل می‌شوند، جفت می‌شوند.

مرحله 3؛ گسترش

هنگامی که به یکدیگر متصل می‌شوند، یک رشته مکمل جدید از DNA را تشکیل می‌دهند (به نام گسترش DNA). بنابراین، یک مولکول DNA دو رشته‌ای تکراری جدید از هر یک از تک رشته‌های مولکول نمونه اصلی تشکیل شده است. چرخه دما از 95 درجه سانتیگراد تا 50 تا 60 درجه سانتیگراد است. سپس این چرخه حدود 35 تا 40 بار با استفاده از سیکل حرارتی که به طور خودکار چرخه‌های گرمایش و سرمایش فرآیند را تکرار می‌کند، تکرار می‌شود. توالی DNA حاصل هر بار که چرخه گرمایش/خنک کردن توسط چرخه‌ساز انجام می‌شود، دو برابر می‌شود. بنابراین، آنچه که به عنوان یک بخش کوتاه از DNA از یک نمونه شروع شد، می‌تواند پس از 35 چرخه دو برابر شدن، برای تشکیل میلیون‌ها نسخه تقویت شود.

تشخیص یا TaqMan

مرحله تشخیص، مبتنی بر فلورسانس است. در این بخش، نمونه باید در یک محیط امن و مناسب نگهداری شود. نمونه همانند پی سی آر باید تحت تاثیر یک سیکل حرارتی قرار گیرد. دستگاه پی سی آر در یک منبع هالوژن قرار می‌گیرد تا فلورسانس به نمونه اضافه شود. سپس سیگنال با تقویت تعداد کپی DNA ، نمونه را تقویت می‌کند. سیگنال ساطع شده توسط یک آشکارساز شناسایی می‌شود و به یک سیگنال دیجیتال تبدیل می‌شود. بعد از تبدیل، اطلاعات بر روی لپ تاپ یا کامپیوتر شما ارسال می‌شود. زمانی که سیگنال به سطح threshold level رسید، قابل تشخیص است.

بیشتر بدانید : منبع تغذیه آزمایشگاهی چیست و کاربردهای آن

کاربرد Real time PCR

تکنیک Real-time PCR یکی از تکنیک‌های نوظهور است که اگرچه برای اولین بار حدود یک دهه پیش توصیف شد، اما به روش انتخابی برای تعیین کمیت سطوح DNA و RNA در سلول‌ها، بافت‌ها و بیوپسی بافت استفاده می‌شود.
فرآیند PCR می‌تواند برای طیف گسترده‌ای از کاربردها و اهداف آزمایشگاهی و بالینی استفاده شود. آزمایشگاه‌های پزشکی قانونی از آن برای تجزیه و تحلیل نمونه‌های DNA از صحنه جرم استفاده می‌کنند.

آزمایشگاه‌های مراقبت‌های بهداشتی بالینی از آن برای تشخیص بیماران آلوده به ویروس استفاده می‌کنند.استفاده از PCR برای تعدادی از کاربردهای بالینی به طور قابل توجهی افزایش یافته است. به عنوان مثال در زمینه میکروبیولوژی بالینی، انکولوژی و ژن درمانی استفاده از ریل تایم پی سی آر به یک روش استاندارد برای تشخیص تبدیل شده است.

نشان داده شده است که Real-time PCR برای تعیین کمیت ویروس‌ها و باکتری‌ها و به میزان کمتری برای قارچ‌ها، انگل‌ها و تک یاخته‌ها بسیار مفید است. استفاده از کیت اندوتوکسین برای پیدایش نژادهای متنوع در باکتری‌ها بسیار کاربری است.
در زمینه انکولوژی بالینی تلاش‌های عمده‌ای برای بهینه‌سازی تکنیک‌های PCR بلادرنگ برای تشخیص پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی و جابه‌جایی‌های کروموزومی انجام شده است.

آزمایشگاه‌های تحقیقات دارویی از آن برای تجزیه و تحلیل، رفرنس استاندارد دارویی و تکثیر نمونه‌های DNA و RNA برای استفاده در ساخت داروها و واکسن‌ها استفاده می‌کنند. چنانچه در زمینه دارویی مورد استفاده قرار دهید نیاز به کیت اندوسیف دارید؛ چرا که برای تشخیص سموم و باکتری‌ها از آن‌ها استفاده می‌شود.
همچنین بدون شک، پرکاربردترین کاربرد Real-time PCR، تعیین کمیت بیان mRNA یا Real-time Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR) است.

نتیجه گیری

ریل تایم پی سی آر تأثیر زیادی در زمینه تحقیقات مولکولی و تشخیص بالینی داشته است، زیرا می‌توان در یک زمان تحقیقاتی بسیار کوتاه به حجم عظیمی از داده‌ها دست یافت. البته این که این دستگاه را از کجا و از چه طریقی تهیه کنید در روند تشخیص و درمان صحیح بسیار تاثیر گذار است. در صورتی که به دلیل نیازهای آزمایشگاهی و پژوهشی یا بسیاری از دلایل پزشکی دیگر به ریل تایم پی سی آر نیاز دارید، می‌توانید از شرکت آرین پژوه سفارشات لازم در این زمینه را انجام دهید. شرکت آرین پژوه بدون هیچ واسطه‌ای و به صورت مستقیم برای شما تجهیزات لازم را تهیه می‌کند.