پلاسمیدها مولکول‌های DNA حلقوی کوچکی هستند که به طور جداگانه از کروموزوم باکتری، در سلول‌های باکتریایی یافت می‌شوند. پلاسمیدها اغلب حاوی ژن‌های مفیدی هستند که می‌توان از آنها برای اهداف مختلفی از جمله مهندسی ژنتیک، تولید پروتئین و درمان بیماری استفاده کرد. استخراج پلاسمید فرآیندی است که DNA پلاسمید را از سلول‌های باکتری جدا کرده و آن را برای مطالعات و کاربردهای بعدی خالص می‌کند. در این مقاله به بررسی اینکه استخراج پلاسمید چیست، نحوه استخراج و مراحل آن می‌پردازیم. بنابراین اگر می‌خواهید بدانید استخراج پلاسمید چیست تا آخر این مقاله همراه ما باشید.

استخراج پلاسمید چیست؟

استخراج پلاسمید روشی برای جداسازی مولکول‌های DNA حلقوی به نام پلاسمید از باکتری‌ها محسوب می‌شود. فرآیند آن شبیه به استخراج ذرات طلا (پلاسمید) از شن و ماسه (مواد باکتریایی) است. دانشمندان باکتری‌ها را شکافته و از مواد شیمیایی خاصی برای حل کردن بیشتر محتویات سلول استفاده می‌کنند، اما پلاسمیدها را دست‌نخورده نگه می‌دارند. سپس محلول حاوی پلاسمید را از بقایای سلولی جدا می‌کنند. در نهایت، DNA پلاسمید را برای استفاده در آزمایش‌های مهندسی ژنتیک تغلیظ و خالص می‌کنند.

تخلیص پلاسمید

خالص سازی پلاسمید، مولکول های DNA حلقوی مورد نظر (پلاسمیدها) را از یک سوپ باکتری جدا می کند. ابتدا باکتری ها با محلول شوینده و pH بالا لیز می شوند و تمام DNA آنها آزاد می شود. سپس یک محلول با pH پایین واکنش را خنثی می کند و DNA پلاسمید را به شکل دایره ای خود بازمی گرداند، در حالی که DNA ژنومی بزرگتر را دناتوره و خطی نگه می دارد. بقایای سلولی به بیرون چرخانده می شوند و محلول شفافی را با DNA باقی می گذارند. این محلول از یک ستون کروماتوگرافی عبور می کند که به طور انتخابی DNA پلاسمید را متصل می کند. ناخالصی‌هایی مانند پروتئین‌ها و RNA شسته می‌شوند و پلاسمید جذب شده را پشت سر می‌گذارند. در نهایت، یک بافر خاص، DNA پلاسمید تمیز را از ستون شستشو می دهد، و DNA خالص شده ممکن است برای کاربردهایی مانند شبیه سازی ژن، توالی یابی، یا ترانسفکشن سلولی متمرکز شود.

مواد مورد نیاز برای استخراج پلاسمید

استراج پلاسمید نیز مانند محصولات سیتوژنتیک نیاز به محصولات و ابزار خاصی دارد. دو روش اصلی برای استخراج پلاسمید مورد استفاده قرار می‌گیرد که هر کدام تجهیزات خاص خود را می خواهند: استفاده از کیت استخراج پلاسمید تجاری یا انجام استخراج پلاسمید دستی.

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای استفاده از کیت استخراج پلاسمید تجاری شامل این موارد می‌شوند:

• سانتریفیوژ
• میکروپیپت ها
• لوله های میکرو سانتریفیوژ
• بافر لیز (در کیت موجود است)
• بافر خنثی سازی (در کیت موجود است)
• بافر شستشو (در کیت موجود است)
• بافر Elution (در کیت موجود است)
• RNase A (معمولاً در کیت موجود است)
• DNA پلاسمید خالص شده (اختیاری، برای کنترل منفی)

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای استخراج پلاسمید دستی عبارتند از:

• سانتریفیوژ
• میکروپیپت ها
• لوله های میکرو سانتریفیوژ
• بافر TE (10 mM Tris-HCl، 1 mM EDTA، pH 8.0)
• محلول لیز (50 mM Tris-HCl، pH 8.0، 10 mM EDTA، 100 میلی گرم در میلی لیتر لیزوزیم)
• محلول خنثی سازی (3 M استات سدیم، pH 5.2)
• فنول/کلروفرم/ایزوآمیل الکل (25:24:1)
• کلروفرم/ایزوآمیل الکل (24:1)
• اتانول 70%
• اتانول 100% (اختیاری)
• RNase A (10 میلی گرم در میلی لیتر)
• همزن مغناطیسی (اختیاری)

بسته به کیت یا پروتکل خاص، ممکن است به مواد اضافی مانند RNase A، ستون ها یا لوله های جمع آوری نیاز داشته باشید. همچنین به یاد داشته باشید که برای جلوگیری از آلودگی DNA پلاسمید، مهم است که در محیط استریل کار کنید.

نحوه استخراج پلاسمید

همانطور که گفتیم، استخراج پلاسمید را می‌توان از طریق دو روش اصلی انجام داد. استفاده از کیت استخراج پلاسمید تجاری روش ساده‌تر است و کیت به تنهایی اکثر بافرها و محلول‌های ضروری برای این فرآیند را در خود جای داده است. علاوه بر کیت، به یک سانتریفیوژ، لوله‌های میکروسانتریفیوژ، پیپت، RNase A (که معمولاً در کیت موجود است)، کشت باکتریایی حاوی پلاسمید مورد نظر و بافر TE (Tris-EDTA، که معمولاً در کیت موجود است) نیاز دارید.
استخراج پلاسمید سنتی روش نیاز به تهیه چندین بافر و محلول دارد. صرف نظر از روشی که انتخاب می‌کنید، اولویت دادن به ایمنی در آزمایشگاه بسیار مهم است. هنگام انجام استخراج، از دستکش، روپوش آزمایشگاهی و عینک ایمنی استفاده کنید. علاوه بر این، یک ظرف زباله مخصوص برای دفع صحیح مواد استفاده شده داشته باشید.

مراحل استخراج پلاسمید

استخراج پلاسمید یک تکنیک حیاتی است و برای انجام آن مراحل خاصی باید دنبال شود، انجام این مراحل نیاز به  خرید مواد شیمیایی آزمایشگاهی دارد. در ادامه خلاصه ای از مراحل متداول را عنوان می‌کنیم.

• رشد کشت باکتری: این مرحله شامل رشد باکتری های حاوی پلاسمید مورد نظر در محیط رشد مناسب می شود. آنتی بیوتیک ها اغلب برای اطمینان از اینکه فقط باکتری های دارای پلاسمید می توانند زنده بمانند گنجانده می شوند.
• برداشت و لیز باکتری ها: سلول های باکتریایی با چرخاندن کشت در یک سانتریفیوژ جمع آوری می گردند. این امر باعث جداسازی سلول ها (پلت) از محیط رشد (سوپرناتانت) می شود. گلوله سلولی مجدداً در یک محلول بافر معلق شده و سپس با استفاده از روش های مختلف لیز می شود.
• خالص سازی DNA پلاسمید: برای جداسازی DNA پلاسمید از بقایای سلولی و سایر آلاینده ها می توان از چندین روش استفاده کرد.
• سانتریفیوژ کردن: محلول دوباره سانتریفیوژ می شود تا آلاینده ها پلت شوند و DNA پلاسمید در مایع رویی باقی بماند.
• کروماتوگرافی ستونی چرخشی: کیت های تجاری اغلب از ستون های چرخشی حاوی ماتریس های مبتنی بر سیلیس استفاده می کنند که DNA پلاسمید را در حضور بافرهای خاص متصل می کنند. آلاینده ها شسته شده و سپس DNA پلاسمید خالص شده از ستون شسته می شود.
• رسوب اتانول: افزودن اتانول به محلول باعث رسوب DNA پلاسمید می شود و سپس می توان آن را با سانتریفیوژ جمع آوری کرد.
• سوسپانسیون مجدد: DNA پلاسمید خالص شده در محلول بافری مانند TE (Tris-EDTA) برای ذخیره سازی و کاربردهای بیشتر معلق می شود.

اینها مراحل کلی هستند و پروتکل های خاص ممکن است بسته به روش انتخابی و کیت های تجاری موجود متفاوت باشد. برای نتایج بهینه همیشه به دستورالعمل های سازنده مراجعه کنید.

نکات مهم استخراج پلاسمید با کیت

فروش کیت آزمایشگاهی برای استخراج پلاسمید انجام می شود که مزایا و معایب خاص خود را دارد. برخی از فاکتورهایی که باید هنگام انتخاب کیت در نظر گرفته شوند عبارتند از:

• مقدار DNA پلاسمید مورد نیاز: برخی از کیت‌ها برای استخراج مقادیر بیشتر DNA پلاسمید مناسب هستند، در حالی که برخی دیگر برای مقادیر کمتر مناسب‌تر هستند.
• خلوص DNA مورد نیاز: برخی از کیت‌ها DNA پلاسمید خالص‌تری را تولید می‌کنند، در حالی که برخی دیگر DNA پلاسمید با خلوص کمتری را تولید می‌کنند.
• سرعت فرآیند استخراج: برخی از کیت‌ها سریع‌تر از سایرین هستند.
• دنبال کردن دقیق پروتکل: کیت‌های استخراج پلاسمید معمولاً با یک پروتکل ارائه می‌شوند که مراحل involved in the extraction process را شرح می‌دهد. مهم است که پروتکل را به دقت دنبال کنید تا مطمئن شوید که بهترین بازده DNA پلاسمید را بدست می‌آورید.
• حفظ محیط استریل: DNA پلاسمید مستعد آلودگی توسط سایر انواع DNA است. مهم است که در طول فرآیند استخراج محیط استریل را حفظ کنید. این شامل استفاده از دستکش، پیپت‌ها و لوله‌های استریل و کار در یک منطقه تمیز است.

کاربردهای استخراج پلاسمید

استخراج پلاسمید تکنیکی بنیادی است که در زمینه‌های مختلف زیست‌شناسی مولکولی کاربرد دارد. پلاسمیدها ابزارهای ضروری برای شبیه‌سازی و دستکاری ژن هستند. پلاسمیدهای استخراج شده می‌توانند با وارد کردن ژن‌های جدید یا تغییر ژن‌های موجود اصلاح شوند. سپس این پلاسمیدهای اصلاح شده می‌توانند برای مطالعه عملکرد ژن یا تولید پروتئین‌های خاص به سلول‌ها برگردانده شوند. DNA پلاسمید به عنوان الگو برای توالی‌یابی DNA عمل می‌کند، که تکنیکی حیاتی برای تعیین ترتیب نوکلئوتیدها در مولکول DNA است. پلاسمیدهای استخراج شده با ژن مورد نظر می‌توانند توالی‌یابی شوند تا کد ژنتیکی آن آشکار گردد.

پلاسمیدهای استخراج شده برای وارد کردن DNA خارجی به سلول‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند که فرآیندی به نام ترانسفورمیشن نامیده می‌شود. این امر به دانشمندان اجازه می‌دهد تا مطالعه کنند که چگونه ژن‌ها در محیط‌های سلولی مختلف عمل می‌کنند.
پلاسمیدها می‌توانند به گونه‌ای مهندسی شوند که حاوی کد ژنتیکی پروتئین مورد نظر باشند. پلاسمیدهای استخراج شده می‌توانند به سلول‌های میزبان وارد شوند که سپس از DNA پلاسمید به عنوان الگو برای تولید پروتئین مورد نظر استفاده می‌کنند. این تکنیکی حیاتی برای تولید انبوه پروتئین‌های درمانی و سایر مولکول‌های زیستی ارزشمند است.

در برخی از رویکردهای ژن درمانی، پلاسمیدهای استخراج شده که حامل نسخه‌های عملکردی ژن‌ها هستند می‌توانند به سلول‌های بیماران منتقل شوند تا نقص‌های ژنتیکی را اصلاح کنند. این امر نویدبخش درمان بیماری‌های ژنتیکی مختلف است.

همچنین پلاسمیدها با وارد کردن ژن‌های مورد نظر به گیاهان، حیوانات یا میکروارگانیسم‌ها نقشی در توسعه GMO دارند. پلاسمیدهای استخراج شده می‌توانند برای اصلاح ارگانیسم‌ها برای صفات کشاورزی بهتر، تولید ترکیبات خاص یا اهداف تحقیقاتی مورد استفاده قرار گیرند.

نتیجه گیری

استخراج پلاسمید فرآیندی اساسی در مهندسی ژنتیک است که به دانشمندان اجازه می‌دهد تا به DNA پلاسمید دسترسی پیدا کرده و از آن برای اهداف مختلفی مانند شبیه‌سازی ژن، بیان پروتئین و مهندسی ژنتیک گیاهان و جانوران استفاده کنند. کیت‌های استخراج پلاسمید ابزاری مفید برای ساده‌سازی و کارآمدتر کردن این فرآیند ارائه می دهند.

آرین پژوه شرکتی پیشرو در ارائه تجهیزات محصولات آزمایشگاهی بهترین قیمت کیت اندوتوکسین در ایران را در اختیار مشتریان قرار می‌دهد. این شرکت طیف گسترده‌ای از کیت‌های استخراج پلاسمید با کیفیت بالا از برندهای معتبر جهانی را به محققان و پژوهشگران ارائه می‌دهد. کیت‌های استخراج پلاسمید آرین پژوه برای طیف وسیعی از نمونه‌های باکتریایی و با روش‌های مختلف استخراج مانند روش‌های مبتنی بر ستون و روش‌های مبتنی بر لیز قلیایی موجود هستند.
با استفاده از کیت‌های استخراج پلاسمید آرین پژوه، می‌توانید به طور موثر و کارآمد DNA پلاسمید با خلوص بالا را استخراج کنید و از آن برای تحقیقات و کاربردهای مختلف خود استفاده نمایید.
برای کسب اطلاعات بیشتر و مشاوره در مورد انتخاب کیت استخراج پلاسمید مناسب برای نیازهای خود، می‌توانید با کارشناسان آرین پژوه تماس بگیرید.