تست اندوتوکسین باکتریایی، سنجشی برای تشخیص و کمیت اندوتوکسینهای باکتریایی است که باعث گرما یا تب در بدن می شود. در صنعت تجهیزات پزشکی، آندوکسینها، جزئی از دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی هستند که معمولاً باعث واکنش تبزایی میشوند. در ادامه بیشتر درباره تست اندوتوکسین به روش LAL میپردازیم تا اطلاعات جامعی نسبت به این روش و اهمیت آن پیدا کنید.
تست LAL چیست؟
تست LAL یک آزمایش اندوتوکسین باکتریایی (BET) است که توسط تولید کنندگان محصولات دارویی در سراسر جهان استفاده میشود. به طور خاص، آزمایش LAL وسیلهای برای تشخیص و در برخی موارد کمی کردن حضور اندوتوکسینها، که به عنوان لیپوپلی ساکارید (LPS) نیز شناخته میشود، ناشی از باکتریهای گرم منفی است. تست LAL به عنوان یک سنجش آزادسازی دستهای برای داروهای تزریقی و دستگاههای پزشکی قبل از توزیع آنها در بازار استفاده میشود.
در واقع آزمایش LAL (لیمولوس آمبوسیت لیزات) که به عنوان آزمایش اندوتوکسین باکتریایی نیز شناخته میشود، یک سنجش آزمایشگاهی است که برای تشخیص حضور و غلظت اندوتوکسینهای باکتریایی در داروها و محصولات بیولوژیکی استفاده میشود و بخش مهمی از میکروبیولوژی دارویی است. اندوتوکسینها که نوعی پیروژن هستند، لیپوپلی ساکاریدهای موجود در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی هستند. پیروژنها به عنوان یک کلاس، مواد تب زا هستند که اگر بیش از غلظتهای خاص برای انسان تجویز شوند، میتوانند مضر یا حتی کشنده باشند. برای چنین آزمایشات حرفهای نیاز به کیت اندوتوکسین دارید.
روش تست اندوتوکسین باکتریایی
دلیل اینکه آزمایش اندوتوکسین باکتریایی LAL یا آزمایش لیمولوس آمبوسیت نیز نامیده میشود، این است که لیزات سلولهای خونی (آمبوسیتها) از خرچنگهای نعل اسبی (نام لاتین limulus Polyphemus است). لیزات سلولهای خون خرچنگ نعل اسبی با اندوتوکسینهای باکتریایی واکنش نشان میدهد.
نمونه ها با معرف LAL در یک صفحه 96 چاهی مخلوط میشوند و یک صفحه تغییر رنگ را در طول زمان اندازه گیری میکند. مایع موجود در چاهکها با گذشت زمان زردتر میشود و سرعت آن تغییر رنگ متناسب با مقدار اندوتوکسین موجود در نمونه است.
تأثیر ترکیبات بازدارنده با استفاده از روش کروموژنیک جنبشی نسبت به سایر روشها تأثیر کمتری دارد. علاوه بر این، روش کروموژنیک جنبشی نسبت به سایر روشهای تست LAL حساستر است.
سنجش LAL چگونه کار می کند؟
توانایی آمبوسیتها برای ایجاد پاسخ قابل مشاهده به حضور اندوتوکسین باکتریایی، وابسته است. سنجش LAL بر اساس عصاره آمبوسیتهای جدا شده (LAL) از خون Limulus polyphemus است. سنجش TAL که مخفف (tachypleus amebocyte lysate) سنجش دوقلو LAL است و عمدتاً در آسیا بر اساس در دسترس بودن خرچنگ نعل اسبی (Tachypleus gigas یا tridentatus) انجام میشود. سه روش اساسی برای آزمایش LAL وجود دارد: لخته ژل، کروموژنیک و کدورت سنجی.
تست لخته ژل LAL
روش ژل لخته LAL اولیه بوده و سادهترین شکل سنجش LAL است. این یک آزمایش کیفی است که در آن تشکیل لخته یا ژل در انتهای لوله نمونه توسط چشم بررسی میشود و نشان دهنده وجود اندوتوکسین در نمونه است.
سنجش LAL کروموژنیک
سنجش LAL کروموژنیک یک آزمایش کمی است که در نتیجه یک واکنش آنزیمی ناشی از فعال شدن فاکتور انعقادی لیمولوس C با حضور اندوتوکسین باکتریایی در نمونه، رنگ زرد (کروموژنیک) تولید میکند. در یک محدوده خاص کیت اندوسیف، شدت رنگ به طور مستقیم با مقدار آلایندههای نمونه متناسب است: هر چه اندوتوکسین بیشتر باشد، محلول زرد قویتر میشود. واکنش LAL کروموژنیک را میتوان (معمولاً با استفاده از واحدهای اندوتوکسین (EU) در هر میلی لیتر یا هر نمونه) با تشخیص جذب با استفاده از اسپکتروفتومتر یا میکروپلیت خوان جذبی تعیین کرد.
نوع جنبشی آزمایش LAL کروموژنیک فاصله زمانی تا شروع واکنش کروموژنیک را پس از افزودن بستر اندازه گیری میکند و مقدار اندوتوکسین نمونههای ناشناخته را بر اساس درون یابی در یک منحنی استاندارد محاسبه میکند. زمان لازم برای ایجاد واکنش کروموژنیک LAL (رنگ زرد) با مقدار اندوتوکسین در نمونه نسبت معکوس دارد.
سنجش LAL کروموژنیک معمولاً برای آزمایش حجمهای کوچکی از مواد مانند آنتیبیوتیکها، واکسنها، داروهای تزریقی و غیره استفاده میشود. به ویژه زمانی که کمیت آن بر روی یک میکروپلیت خوان مشخص شود، مزایای سنجش LAL کروموژنیک امکان افزایش کارایی و توان عملیاتی و خودکارسازی است.
سنجش کدورت سنجی LAL
نوع کدورت سنجی آزمایش LAL معمولاً زمانی استفاده میشود که نمونهها دارای یک رنگ ذاتی هستند که میتواند با بازخوانی زرد آزمایش LAL کروموژنیک تداخل داشته باشد. در این حالت از لخته شدن LAL برای تولید ذراتی استفاده میشود که محلول را کدر میکند. سپس کدورت نمونه اندازه گیری میشود و تحت تأثیر رنگ نمونه قرار نمیگیرد.
سنجش LAL بر روی میکروپلیت خوان
هر دو روش LAL کروموژنیک و کدورت سنجی را میتوان در صفحه خوان اندازه گیری کرد. این رویکردها کاملاً ساده هستند و فقط به یک میکروپلیت خوان جذبی نیاز دارند تا شروع رنگ زرد واکنش LAL کروموژنیک را در طول موج 405-410 نانومتر تشخیص دهد، یا تغییرات در کدورت برای سنجش کدورت سنجی LAL در طول موج 340 نانومتر را در نظر گیرند.
همچنین میتوان از نرم افزار تجزیه و تحلیل دادههای MARS برای انجام محاسبات جنبشی استفاده کرد. برای این آزمایش مقایسه زمانی که هر نمونه طول میکشد تا به آستانه OD مشخصی برسد مهم است و برای مقایسه نمونههایی با غلظتهای شناخته شده و ایجاد یک منحنی استاندارد که برای محاسبه مجهولات استفاده میشود را باید در نظر داشت.
سنجش LAL و رفاه حیوانات
متأسفانه، تولید LAL وابسته به یک فرآیند نسبتاً خام است که شامل صید خرچنگ نعل اسبی (بیش از 500000 فقط در سال 2015) میشود تا بتوان مقداری خون جمع آوری کرد. حجم خونگیری بسته به جنس و اندازه میتواند بین 50 تا 400 میلی لیتر باشد. خون سانتریفیوژ میشود تا آمبوسیتها را متمرکز کند و سپس لیز میشوند تا پروتئینهای انعقادی، همان LAL، آزاد شوند. اگرچه خرچنگهای نعل اسبی میتوانند پس از خونریزی رها شوند، اما تعداد معینی (10 تا 30%) در طول فرآیند انتقال یا استخراج خون از بین میروند. عوارض بیشتر ممکن است منجر به مرگ پس از رهاسازی شود که مستقیماً با تولید آزمایش LAL مرتبط نیست.
همچنین خرید مواد شیمیایی برای انجام این آزمایشات نیز ممکن است عوارض دیگری با خود به همراه داشته باشد.
مسئله دیگر این است که شکار لیمولوسها در طول جفت گیری اتفاق میافتد؛ زیرا این زمانی است که آنها به ساحل میآیند. مشخص نیست که این مجموعه چه تأثیری بر ظرفیت تولید مثل، به ویژه در میان زنان اسیر شده دارد. آنچه واضح است این است که تعداد خرچنگهای نعل اسبی رو به کاهش است و جمع آوری انسان برای آزمایش LAL مطمئناً یک عامل کمک کننده است.
تلاشهایی برای اطمینان از اقدامات بهتر در جمعآوری خرچنگها از جمله شناسایی بهترین مکانیسمهای حملونقل، درک بهترین دما برای استفاده و محدود کردن زمان خارج شدن از آب در حال انجام است. محدود کردن شکار مادههای این گونه نیز به عنوان راهی برای ارتقای ظرفیت تولید مثلی بالاتر پیشنهاد شده است. علاوه بر این، درک بهتری از تأثیر فرآیند خونریزی باید به دست آید. این باید شامل مقدار خونی باشد که میتوان به طور ایمن از یک فرد با اندازه معین گرفت. متأسفانه، «پرورش» خرچنگهای نعل اسبی تاکنون بسیار ناموفق بوده است؛ بنابراین تا زمانی که تقاضا وجود داشته باشد، صید خرچنگهای وحشی ادامه خواهد داشت.
نتیجه گیری
تست اندوتوکسین با کیت اندوتوکسین بایواندو با وجود این که در حوزه پزشکی مزایای بسیار زیادی با خود به همراه دارد، معایبی با خود دارد. برای مثال تعداد خرچنگهای نعل اسبی روزبهروز در حال کاهش پیدا کردن است؛ به همین خاطر باید در کنار آزمایشاتی که صورت میگیرد، دقت کافی به مقدار و تعداد آنها نیز داشت.
برای خرید انواع تجهیزات آزمایشگاهی همچون کیت اندو سیف میتوانید از فروشگاه و وب سایت آرین پژوه کمک بگیرید. این فروشگاه بزرگ به فروش کیت آزمایشگاهی و دیگر تجهیزات مربوط به آزمایشگاه معروف است.
سوالات متداول
تست اندوتوکسین به روش LAL چیست؟
یک سنجش آزمایشگاهی است که برای تشخیص حضور و غلظت اندوتوکسینهای باکتریایی در داروها و محصولات بیولوژیکی استفاده میشود.
تست اندوتوکسین به روش LAL شامل چند نوع است؟
سه روش اساسی برای آزمایش LAL وجود دارد: لخته ژل، کروموژنیک و کدورت سنجی.
آیا با وجود آزمایشات LAL حیوانات در رفاه هستند؟
خیر. روزبهروز تعداد خرچنگهای نعل اسبی روبه کاهش است.