22888840
درخواست پیش فاکتور
22888840
0
تست اندوتوکسین

تست اندوتوکسین باکتریایی، سنجشی برای تشخیص و کمیت اندوتوکسین‎های باکتریایی است که باعث گرما یا تب در بدن می شود. در صنعت تجهیزات پزشکی، آندوکسین‌‎ها، جزئی از دیواره سلولی باکتر‎ی‌‎های گرم منفی هستند که معمولاً باعث واکنش تب‌زایی می‌‎شوند. در ادامه بیشتر درباره تست اندوتوکسین به روش LAL می‎پردازیم تا اطلاعات جامعی نسبت به این روش و اهمیت آن پیدا کنید. 

تست LAL چیست؟

تست LAL یک آزمایش اندوتوکسین باکتریایی (BET) است که توسط تولید کنندگان محصولات دارویی در سراسر جهان استفاده می‎شود. به طور خاص، آزمایش LAL وسیله‎ای برای تشخیص و در برخی موارد کمی کردن حضور اندوتوکسین‎ها، که به عنوان لیپوپلی ساکارید (LPS) نیز شناخته می‎شود، ناشی از باکتری‎های گرم منفی است. تست LAL به عنوان یک سنجش آزادسازی دسته‎ای برای داروهای تزریقی و دستگاه‎های پزشکی قبل از توزیع آن‎ها در بازار استفاده می‎شود.

در واقع آزمایش LAL (لیمولوس آمبوسیت لیزات) که به عنوان آزمایش اندوتوکسین باکتریایی نیز شناخته می‎شود، یک سنجش آزمایشگاهی است که برای تشخیص حضور و غلظت اندوتوکسین‎های باکتریایی در داروها و محصولات بیولوژیکی استفاده می‎شود و بخش مهمی از میکروبیولوژی دارویی است. اندوتوکسین‌‎ها که نوعی پیروژن هستند، لیپوپلی ساکاریدهای موجود در دیواره سلولی باکتری‎های گرم منفی هستند. پیروژن‎ها به عنوان یک کلاس، مواد تب زا هستند که اگر بیش از غلظت‎های خاص برای انسان تجویز شوند، می‎توانند مضر یا حتی کشنده باشند. برای چنین آزمایشات حرفه‎ای نیاز به کیت اندوتوکسین دارید. 

روش تست اندوتوکسین باکتریایی

روش تست اندوتوکسین

دلیل اینکه آزمایش اندوتوکسین باکتریایی LAL یا آزمایش لیمولوس آمبوسیت نیز نامیده می‎شود، این است که لیزات سلول‎های خونی (آمبوسیت‎‎‎‎ها) از خرچنگ‎های نعل اسبی (نام لاتین limulus Polyphemus است). لیزات سلول‎ه‎ای خون خرچنگ نعل اسبی با اندوتوکسین‎های باکتریایی واکنش نشان می‎دهد.

نمونه ها با معرف LAL در یک صفحه 96 چاهی مخلوط می‎شوند و یک صفحه تغییر رنگ را در طول زمان اندازه گیری می‎کند. مایع موجود در چاهک‎ها با گذشت زمان زردتر می‎شود و سرعت آن تغییر رنگ متناسب با مقدار اندوتوکسین موجود در نمونه است.

تأثیر ترکیبات بازدارنده با استفاده از روش کروموژنیک جنبشی نسبت به سایر روش‎ها تأثیر کم‎تری دارد. علاوه بر این، روش کروموژنیک جنبشی نسبت به سایر روش‌‎های تست LAL حساس‌‎تر است.

سنجش LAL چگونه کار می کند؟

توانایی آمبوسیت‎ها برای ایجاد پاسخ قابل مشاهده به حضور اندوتوکسین باکتریایی، وابسته است. سنجش LAL بر اساس عصاره آمبوسیت‎های جدا شده (LAL) از خون Limulus polyphemus است. سنجش TAL که مخفف (tachypleus amebocyte lysate) سنجش دوقلو LAL است و عمدتاً در آسیا بر اساس در دسترس بودن خرچنگ نعل اسبی (Tachypleus gigas یا tridentatus) انجام می‎شود. سه روش اساسی برای آزمایش LAL وجود دارد: لخته ژل، کروموژنیک و کدورت سنجی.

تست لخته ژل LAL

روش ژل لخته LAL اولیه بوده و ساده‎ترین شکل سنجش LAL است. این یک آزمایش کیفی است که در آن تشکیل لخته یا ژل در انتهای لوله نمونه توسط چشم بررسی می‎شود و نشان دهنده وجود اندوتوکسین در نمونه است.

سنجش LAL کروموژنیک

سنجش LAL کروموژنیک چیست

سنجش LAL کروموژنیک یک آزمایش کمی است که در نتیجه یک واکنش آنزیمی ناشی از فعال شدن فاکتور انعقادی لیمولوس C با حضور اندوتوکسین باکتریایی در نمونه، رنگ زرد (کروموژنیک) تولید می‎کند. در یک محدوده خاص کیت اندوسیف، شدت رنگ به طور مستقیم با مقدار آلاینده‎های نمونه متناسب است: هر چه اندوتوکسین بیشتر باشد، محلول زرد قوی‎تر می‎شود. واکنش LAL کروموژنیک را می‎توان (معمولاً با استفاده از واحدهای اندوتوکسین (EU) در هر میلی لیتر یا هر نمونه) با تشخیص جذب با استفاده از اسپکتروفتومتر یا میکروپلیت خوان جذبی تعیین کرد.

نوع جنبشی آزمایش LAL کروموژنیک فاصله زمانی تا شروع واکنش کروموژنیک را پس از افزودن بستر اندازه گیری می‌‎کند و مقدار اندوتوکسین نمونه‎های ناشناخته را بر اساس درون یابی در یک منحنی استاندارد محاسبه می‎کند. زمان لازم برای ایجاد واکنش کروموژنیک LAL (رنگ زرد) با مقدار اندوتوکسین در نمونه نسبت معکوس دارد.

سنجش LAL کروموژنیک معمولاً برای آزمایش حجم‌‎های کوچکی از مواد مانند آنتی‌بیوتیک‌‎ها، واکسن‌‎ها، داروهای تزریقی و غیره استفاده می‌‎شود. به‌ ویژه زمانی که کمیت آن بر روی یک میکروپلیت خوان مشخص شود، مزایای سنجش LAL کروموژنیک امکان افزایش کارایی و توان عملیاتی و خودکارسازی است.

سنجش کدورت سنجی LAL

نوع کدورت سنجی آزمایش LAL معمولاً زمانی استفاده می‎شود که نمونه‎ها دارای یک رنگ ذاتی هستند که می‎تواند با بازخوانی زرد آزمایش LAL کروموژنیک تداخل داشته باشد. در این حالت از لخته شدن LAL برای تولید ذراتی استفاده می‎شود که محلول را کدر می‎کند. سپس کدورت نمونه اندازه گیری می‎شود و تحت تأثیر رنگ نمونه قرار نمی‎گیرد.

سنجش LAL بر روی میکروپلیت خوان

منظور از سنجش LAL بر روی میکروپلیت خوان چیست

هر دو روش LAL کروموژنیک و کدورت سنجی را می‎توان در صفحه خوان اندازه گیری کرد. این رویکردها کاملاً ساده هستند و فقط به یک میکروپلیت خوان جذبی نیاز دارند تا شروع رنگ زرد واکنش LAL کروموژنیک را در طول موج 405-410 نانومتر تشخیص دهد، یا تغییرات در کدورت برای سنجش کدورت سنجی LAL در طول موج 340 نانومتر را در نظر گیرند. 

همچنین می‎توان از نرم افزار تجزیه و تحلیل داده‎های MARS برای انجام محاسبات جنبشی استفاده کرد. برای این آزمایش مقایسه زمانی که هر نمونه طول می‎کشد تا به آستانه OD مشخصی برسد مهم است و برای مقایسه نمونه‎هایی با غلظت‎های شناخته شده و ایجاد یک منحنی استاندارد که برای محاسبه مجهولات استفاده می‎شود را باید در نظر داشت. 

سنجش LAL و رفاه حیوانات

متأسفانه، تولید LAL وابسته به یک فرآیند نسبتاً خام است که شامل صید خرچنگ نعل اسبی (بیش از 500000 فقط در سال 2015) می‎شود تا بتوان مقداری خون جمع آوری کرد. حجم خونگیری بسته به جنس و اندازه می‎تواند بین 50 تا 400 میلی لیتر باشد. خون سانتریفیوژ می‌‎شود تا آمبوسیت‌‎ها را متمرکز کند و سپس لیز می‌‌‎شوند تا پروتئین‌‎های انعقادی، همان LAL، آزاد شوند. اگرچه خرچنگ‌‎های نعل اسبی می‌‎توانند پس از خونریزی رها شوند، اما تعداد معینی (10 تا 30%) در طول فرآیند انتقال یا استخراج خون از بین می‌‎روند. عوارض بیشتر ممکن است منجر به مرگ پس از رهاسازی شود که مستقیماً با تولید آزمایش LAL مرتبط نیست.

همچنین خرید مواد شیمیایی برای انجام این آزمایشات نیز ممکن است عوارض دیگری با خود به همراه داشته باشد. 

مسئله دیگر این است که شکار لیمولوس‎ها در طول جفت گیری اتفاق می‎افتد؛ زیرا این زمانی است که آن‎ها به ساحل می‎آیند. مشخص نیست که این مجموعه چه تأثیری بر ظرفیت تولید مثل، به ویژه در میان زنان اسیر شده دارد. آنچه واضح است این است که تعداد خرچنگ‎های نعل اسبی رو به کاهش است و جمع آوری انسان برای آزمایش LAL مطمئناً یک عامل کمک کننده است.

تلاش‌‎هایی برای اطمینان از اقدامات بهتر در جمع‌آوری خرچنگ‌‎ها از جمله شناسایی بهترین مکانیسم‌‎های حمل‌ونقل، درک بهترین دما برای استفاده و محدود کردن زمان خارج شدن از آب در حال انجام است. محدود کردن شکار ماده‌‎های این گونه نیز به عنوان راهی برای ارتقای ظرفیت تولید مثلی بالاتر پیشنهاد شده است. علاوه بر این، درک بهتری از تأثیر فرآیند خونریزی باید به دست آید. این باید شامل مقدار خونی باشد که می‎توان به طور ایمن از یک فرد با اندازه معین گرفت. متأسفانه، «پرورش» خرچنگ‎های نعل اسبی تاکنون بسیار ناموفق بوده است؛ بنابراین تا زمانی که تقاضا وجود داشته باشد، صید خرچنگ‎های وحشی ادامه خواهد داشت.

نتیجه گیری 

تست اندوتوکسین با کیت اندوتوکسین بایواندو با وجود این که در حوزه پزشکی مزایای بسیار زیادی با خود به همراه دارد، معایبی با خود دارد. برای مثال تعداد خرچنگ‌‎های نعل اسبی روزبه‎روز در حال کاهش پیدا کردن است؛ به همین خاطر باید در کنار آزمایشاتی که صورت می‌‎گیرد، دقت کافی به مقدار و تعداد آن‌‎ها نیز داشت. 

برای خرید انواع تجهیزات آزمایشگاهی همچون کیت اندو سیف می‌‎توانید از فروشگاه و وب سایت آرین پژوه کمک بگیرید. این فروشگاه بزرگ به فروش کیت آزمایشگاهی و دیگر تجهیزات مربوط به آزمایشگاه معروف است. 

سوالات متداول

تست اندوتوکسین به روش LAL چیست؟

یک سنجش آزمایشگاهی است که برای تشخیص حضور و غلظت اندوتوکسین‎های باکتریایی در داروها و محصولات بیولوژیکی استفاده می‎شود.

تست اندوتوکسین به روش LAL شامل چند نوع است؟

سه روش اساسی برای آزمایش LAL وجود دارد: لخته ژل، کروموژنیک و کدورت سنجی.

آیا با وجود آزمایشات LAL حیوانات در رفاه هستند؟

خیر. روزبه‌‎روز تعداد خرچنگ‎های نعل اسبی روبه کاهش است.